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猪用生物制品及有关猪源原辅资猜中

  非洲猪瘟病毒核酸检测步骤

1  合用领域

1.1猪用及选取猪源原辅资料造备的生物制品制品及半制品。。。。。。

1.2猪源毒种。。。。。。 

1.3 猪源细胞及有关制品出产用细胞。。。。。。

1.4其他猪源原辅资料（如组织、血清、胰酶衍生物等）。。。。。。

2  取样和处置

2.1 疫苗

2.1.1  活疫苗  取至少2瓶样品，，，，，，按瓶签注明头份用合适稀释液别离稀释成10头份/0.2ml，，，，，，等量混合，，，，，，取混合液进行核酸提取。。。。。。

2.1.2  灭活疫苗  取至少2瓶样品，，，，，，等量混合后进行以下处置。。。。。。

2.1.2.1 油佐剂灭活疫苗  取36 ml混合疫苗，，，，，，参与正戊醇4.0 ml，，，，，，充分振荡混合1分钟，，，，，，2～8℃冰箱静置不少于60分钟，，，，，，直至油相和水相分离。。。。。。取水相进行核酸提取。。。。。。

2.1.2.2 水性佐剂灭活疫苗

2.1.2.2.1铝胶佐剂灭活疫苗  取混合疫苗5.0 ml，，，，，，摇匀，，，，，，参与0.25 g解离剂CPG-odn（人为合成的寡聚核苷酸），，，，，，放入摇床（200 r/min）37℃解离1幼时，，，，，，5000 r/min离心10分钟，，，，，，取上清液进行核酸提取。。。。。。

2.1.2.2.2其他水性佐剂灭活疫苗  直接取混合样品进行核酸提取。。。。。。

2.2 其他生物制品和半制品冻干类制品，，，，，，按活疫苗进行取样和处置；；；；；液体制品及半制品，，，，，，取至少2份（瓶）样品，，，，，，等量混合，，，，，，取混合液进行核酸提取。。。。。。

2.3 猪源毒种  取至少2支毒种。。。。。。冻干毒种，，，，，，按冻干前体积复溶后等量混合，，，，，，取混合液进行核酸提。。。。。。唬；；；非冻干毒种，，，，，，等量混合后直接取混合液进行核酸提取。。。。。。

2.4 猪源细胞  除还有划定表，，，，，，取至少2瓶细胞浓度不少于10^7.0个细胞/ml的细胞悬液进行核酸提取。。。。。。

2.5 其他猪源原辅资料

2.5.1 猪组织  每种组织，，，，，，别离取样和处置。。。。。。取不少于2.0 g组织，，，，，，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，，，，，，70℃灭活30分钟，，，，，，4℃下以2000～3000 g离心10分钟，，，，，，取上清液进行核酸提取。。。。。。

2.5.2 猪血清  每批血清取至少2个最幼包装的样品，，，，，，等量混合，，，，，，取混合液进行核酸提取。。。。。。

2.5.3 猪胰酶  干粉状胰酶，，，，，，取至少2份样品，，，，，，凭据使用情况别离配造成不低于2.5%浓度的溶液，，，，，，等量混合，，，，，，取混合液进行核酸提。。。。。。唬；；；液体胰酶，，，，，，取至少2个最幼包装的样品，，，，，，等量混合，，，，，，取混合液进行核酸提取。。。。。。

2.5.4 其他猪源衍生物  固体、液体或干粉状猪源衍生物，，，，，，可别离按组织、血清或干粉状胰酶的步骤进行取样和样品处置。。。。。。

3  核酸提取

3.1 试剂和器材

3.1.1 试剂  凭据核酸提取步骤确定，，，，，，如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1 mol/l 柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇等。。。。。。

3.1.2 仪器  核酸含量测定仪；；；；；常温台式离心理；；；；；旋涡振荡器；；；；；水浴锅；；；；；微量移液器1套（最大量程别离为10 ?l、100 ?l、200 ?l、1000 ?l）。。。。。。

3.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、无菌吸头（0～10 ?l、0～200 ?l、100～1000 ?l）、一次性乳胶手套。。。。。。

3.2  操作法式（TRIZOL法），，，，，，也能够选择其他等效核酸提取步骤提取样品中的DNA。。。。。。

3.2.1 取样品250 ?l，，，，，，参与750 ?l Trizol，，，，，，颠倒混匀，，，，，，室温搁置5分钟。。。。。。

3.2.2 参与200 ?l氯仿，，，，，，充分混匀，，，，，，室温搁置10 分钟，，，，，，4℃下以12000 g离心15 分钟。。。。。。

3.2.3 弃去上清液，，，，，，参与220 ?l无水乙醇，，，，，，颠倒混合，，，，，，15～30℃搁置2～3分钟，，，，，，2～8℃以2000 g离心5分钟，，，，，，沉淀物为DNA。。。。。。

3.2.4 弃去上清液，，，，，，参与含10%乙醇的0.1 mol/l 柠檬酸钠750 ?l洗涤DNA，，，，，，15～30℃搁置30分钟，，，，，，2～8℃以2000 g离心5分钟。。。。。。沉复一次。。。。。。

3.2.5 参与75%乙醇1.2 ml，，，，，，沉悬DNA沉淀，，，，，，15～30℃搁置20分钟，，，，，，4℃2000 g离心5分钟。。。。。？？？？？沙粮匆淮，，，，，，充分洗涤DNA沉淀。。。。。。

3.2.6 弃去上清液，，，，，，敞开离心管管口，，，，，，在空气中干燥5～10分钟，，，，，，参与30～50 μl的无核酸酶灭菌水溶化DNA，，，，，，－20℃以下保留备用。。。。。。

3.3  当苦衷项

3.3.1核酸提取试剂拥有侵蚀和强变机能力，，，，，，应做好幼我防护，，，，，，佩带手套、口罩和护目镜，，，，，，预防液体飞溅到皮肤和眼睛。。。。。。

3.3.2后续的核酸检测敏感性很高，，，，，，要预防样品之间相互传染，，，，，，最好使用带滤芯的枪头，，，，，，且每次汲取取液体时均需更换枪头。。。。。。

3.3.3为预防核苷酸降解，，，，，，应预防核酸酶传染，，，，，，使用的耗材均需无核酸酶。。。。。。

3.3.4做好渣滓样品的无害化处置及操作台面的消毒处置。。。。。。渣滓样品可通过高压灭菌或煮沸处置，，，，，，也可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处置，，，，，，操作台面使用1%卫可擦拭。。。。。。

3.3.5提取后的DNA样品要用锡箔纸封存，，，，，，取样时利用枪头直接刺破锡箔纸取样，，，，，，预防传染。。。。。。

4  检测

下列两种步骤可任选其一。。。。。。

4.1  实时荧光定量PCR检测法

4.1.1 试剂和器材

4.1.1.1 试剂

4.1.1.1.1 荧光定量PCR试剂  本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit为例，，，，，，也可选用其他荧光定量PCR试剂。。。。。。

4.1.1.1.2 扩增引物及探针

扩增引物：

ASF-05-Zsak-1466F（10 ?mol/ L）：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'

ASF-05-Zsak-1528R（10 ?mol/ L）：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'

探针ASF-05-Zsak-1486prob (10 ?mol/ L)：5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'

4.1.1.1.3  无核酸酶的灭菌水  PCR级别。。。。。。

4.1.1.2  仪器  荧光定量PCR仪；；；；；微量移液器1套（最大量程别离为10 ?l、100 ?l、200 ?l、1000 ?l）。。。。。。

4.1.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、荧光定量PCR 96孔板、0.1 ml荧光PCR八连管、无菌吸头（0～10 ?l、0～200 ?l、100～1000 ?l）、一次性乳胶手套。。。。。。

4.1.2  操作法式

4.1.2.1 样品DNA造备  依照前述步骤进行核酸提取。。。。。。

4.1.2.2 反映系统的配造  配造比样品数量至少多4个的反映系统，，，，，，同时设置强阳性、弱阳性和阴性对照。。。。。。在强阳性和弱阳性对照反映管平别离参与含有非洲猪瘟P72基因的尺度质粒DNA各3 ?l，，，，，，在阴性对照反映管中参与3?l无核酸酶灭菌水。。。。。。每个PCR反映管中应蕴含以下成分：

4.1.2.3  反映法式  将所有待检样品和强阳性、弱阳性、阴性对照反映管放在荧光定量PCR仪中，，，，，，依照以下法式进行扩增：50℃2分钟，，，，，，95℃5分钟，，，，，，95℃15秒，，，，，，58℃退火延长1分钟，，，，，，45个循环（荧光信号网络在此阶段每次循环的退火延长时进行）。。。。。。

4.1.2.4  了局判定

4.1.2.4.1  阈值设定  试验操作实现后，，，，，，确定Ct值。。。。。。Ct值为每个样品反映管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。。。。。。

阈值设定准则：凭据仪器噪声情况进行调整，，，，，，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。。。。。。

4.1.2.4.2  质控尺度

对照组的检测了局应切合以下情况，，，，，，这次检测方为有效：

阴性对照无Ct 值，，，，，，且无扩增曲线。。。。。。

强阳性对照的Ct 值应在18～22之间，，，，，，并出现典型的扩增曲线。。。。。。弱阳性对照的Ct 值应在33～35之间，，，，，，并出现典型的扩增曲线。。。。。。

4.1.2.4.3  判定

阴性：无Ct值，，，，，，且未出现扩增曲线，，，，，，判定为样品中无ASFV核酸。。。。。。

阳性：Ct值≤40，，，，，，且出现典型的扩增曲线，，，，，，判定为样品中存在ASFV核酸。。。。。。

可疑：Ct值>40，，，，，，且出现典型扩增曲线，，，，，，判定为可疑，，，，，，应沉检。。。。。。沉检后，，，，，，Ct值≤40且出现典型扩增曲线者判为阳性，，，，，，其他情况均判定为阴性。。。。。。

4.2  通常 PCR检测法

4.2.1  试剂和器材

4.2.1.1  试剂

4.2.1.1.1 PCR试剂  10×PCR缓冲液（含25 mmol/l  Mg²⁺），，，，，，DNA扩增酶，，，，，，dNTP预混液。。。。。。

4.2.1.1.2扩增引物

primer PPA-1（10 μmol/L）：5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物)；；；；；

primer PPA-2（10 μmol/L）：5'- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3' (下游引物)。。。。。。

4.2.1.1.3  DNA分子量尺度品  DL500。。。。。。

4.2.1.1.4  TAE电泳缓冲液  配造步骤见《电泳液尺度配造流程》。。。。。。

4.2.1.1.5  1%琼脂糖凝胶板  在100 ml 1×TAE缓冲液中参与1g琼脂糖，，，，，，加热消融，，，，，，参与5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙锭，，，，，，混匀，，，，，，倒入水平搁置的凝胶盘中，，，，，，胶板厚度达5.0 mm左右。。。。。。凭据样品数量选用合适的梳子。。。。。。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，，，，，，放入电泳槽中，，，，，，加1×TAE缓冲液覆没胶面。。。。。。

4.2.1.2 仪器  DNA扩增仪，，，，，，稳压稳流电泳仪，，，，，，水平电泳槽，，，，，，凝胶成相系统（或紫表透射仪），，，，，，微量移液器1套。。。。。。

4.2.1.3 耗材  1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、无菌吸头（0～10 ?l、0～200 ?l、100～1000 ?l）。。。。。。

4.2.2 操作法式

4.2.2.1 样品DNA造备  依照前述步骤进行核酸提取。。。。。。

4.2.2.2 反映系统的配造  配造比样品数量至少多3个的反映系统，，，，，，同时设立阳性和阴性对照。。。。。。在阳性对照反映管中参与非洲猪瘟P72基因沉组质粒2.0 ?l，，，，，，在阴性对照反映管中参与2.0 ?l无核酸酶灭菌水。。。。。。每个PCR反映管中应蕴含以下成分：

4.2.2.3  反映法式  将所有待检样品及阳性和阴性对照反映管放在PCR仪中，，，，，，依照以下法式进行扩增：94℃2分钟，，，，，，94℃30秒，，，，，，60℃30秒，，，，，，72℃30秒，，，，，，35个循环；；；；；72℃10分钟。。。。。。4℃保留。。。。。。

4.2.2.4  PCR扩增产品分析  取PCR扩增产品10 ?l，，，，，，加6×加样缓冲液2.0 ?l，，，，，，混匀，，，，，，用1.5%琼脂糖凝胶对混合物进行电泳分析，，，，，，电压120V，，，，，，电流50 mA，，，，，，电泳功夫30分钟。。。。。。电泳实现后，，，，，，用凝胶成像系统拍照，，，，，，纪录检测了局。。。。。。

4.2.2.5 了局判定

4.2.2.5.1 质控尺度

对照组的检测了局应切合以下情况，，，，，，这次检测方为有效：

阴性对响应不出现257bp的特异性条带。。。。。。

阳性对响应出现257bp的特异性条带。。。。。。

4.2.2.5.2 判定

阳性：待检样品出现与阳性对照大幼一致的扩增条带，，，，，，判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性，，，，，，扩增产品可通过DNA测序进一步确定基因型。。。。。。

阴性：待检样品未出现与阳性对照大幼一致的扩增条带，，，，，，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。。。。。。

4.3  当苦衷项

4.3.1检测过程中应遵循PCR尝试分区准则，，，，，，即应分辨试剂配造区、样本处置区、核酸扩增区。。。。。。

4.3.2应预防在含有靶序列的区域中使用引物，，，，，，预防传染靶序列。。。。。。